Ce substrat de culture qu'utilisent les labos...

[moustache]

En définitive, faire un milei correct avec les moyens du bord est assez simple!

Il y a encore plus simple :
de l'eau
Tu mets une branche de laurier rose et .... miracle, ça pousse
Le problème n'est pas le milieu, mais la stérilisation de celui ci et de l'implant, pour éviter l'envahissement par les moisissures, champignons et autre bactéries.
A l'an qué ven

[ugli]

La stérilistation du milieu est très facile => bocaux dans une cocotte minute

Pour l'implant ce n'est pas difficile non plus, eau de javel ou rien du tout si l'on part d'un méristème. L'aseptie est facile, les ratés rares.

Evidemment moustache cette technique n'a d'intérêt en production que pour des plantes qui ne se bouturent pas de façon traditionnelle, ou dont on veut plusieurs milliers d'exemplaires très rapidement.

[moustache]

La stérilistation du milieu est très facile => bocaux dans une cocotte minute

Pour l'implant ce n'est pas difficile non plus, eau de javel ou rien du tout si l'on part d'un méristème. L'aseptie est facile, les ratés rares.

Facile...Facile Est ce que tu as déja pratiqué la multiplication in vitro
j'ai essayé avec le kit de micropropagation du saint paulia de Korano flor, il y a quelques années.

http://encyclo.free.fr/pages/in_vitro.htm#Remerciements

Malgré toutes les précautions prises, tous les flacons ont été contaninés par des levures ou champignons (mauvaise désinfection des explants à l'hypochlorite de calcium).

[ugli]

Oui je l'ai fait, en cours avec de la carotte

Et c'est facile, d'ailleurs sur tous les groupes il y avait vraiment très peu de bocaux contaminés

[ocalm]

Par tatonement on peut avoir la composition d’un milieu nutritif convenable à une plante .
Exemple : le milieu de Knop dont la composition est la suivante :
Nitrate de calcium 1 g
Nitrate de potassium 0.25 g
Phosphate mono potassique 0.25 g
Sulfate de magnésium 0.25 g
Phosphate de fer traces
Eau 1000 g ,

ceci peut te servir de base pour commencer tes mélanges nutritifs.

[Jean-Pierre]

Je suis d'accord avec Moustache : La difficulté ça n'est pas de produire un milieu correct, ni même le stériliser. La difficulté c'est d'introduire les meristèmes ou les graines sans contaminer le milieu.
J'ai suffisamment vu des semis d'orchidées sur ce genre de substrat, pour dire que la principale cause d'échec c'est la contamination.
Evidemment chez les pros avec du matériel genre hotte à flux laminaire c'est sans problème. Chez les amateurs on en est réduit à bricoler avec des techniques du 19eme siècle : La plus courante est l'utilisation d'une lampe à alcool ou d'un bec Bunsen pour produire une zone stérile autour de l'entrée du tube de semis.
Qu'est-ce que tu utilises Ugli ? Ce serait bien de nous donner quelques tuyaux. J'ai été très impressionné quand tu as écrit que ça permettait même le semis d'orchidées indigènes alors qu'elles sont réputées de propagation très difficile. Merci de détailler un peu tout ça.

JP

[aldau]

Bonjour,
Je suis intéressé moi aussi par le fait de donner plus de chance de reprise à une bouture. Le milieu stérile me parait intéressant pour réaliser cela.
Serait il possible comme le disait Ugli un peu plus haut de mettre au point un milieu de bouturage "a la bonne franquette" ? C'est à dire en utilisant les produits que tout le monde puisse facilement trouver quel qu'il soit.

[TiFiDuS]

Je suis d'accord avec Moustache : La difficulté ça n'est pas de produire un milieu correct, ni même le stériliser. La difficulté c'est d'introduire les meristèmes ou les graines sans contaminer le milieu.
J'ai suffisamment vu des semis d'orchidées sur ce genre de substrat, pour dire que la principale cause d'échec c'est la contamination.
Evidemment chez les pros avec du matériel genre hotte à flux laminaire c'est sans problème.

laissez tomber, il a raison. Sans hotte ni désinfection approprié c'est l'echec assuré !

J'en ai fait pas mal en cours et je peux vous dire que c'est pas evidant, il faut que tout soit parfaitement désinfecté. La salle de repiquage j'en parle meme pas. Tous les outils sont plongés dans l'alcool a chaque coups. 4 hrs de repiquages et on été choutés.

[aldau]

Sans chercher à refaire une plante complète à partir d'une cellule, je conçois bien que c'est quasi irréalisable pour un particulier avec seulement sa lampe à alcool pour désinfecter l'atmosphère.
Je me demandais simplement si on ne pouvais pas grandement améliorer les chances de reprise des boutures en utilisant des techniques plus aseptique.

[Jesus666]

et si on mets de l'engrais soluble complet type hydropponique, dans de la gelée ? peut etre que ca marcherais ?

[moustache]

et si on mets de l'engrais soluble complet type hydropponique, dans de la gelée ? peut etre que ca marcherais ?

Mais tu auras toujours le problème de désinfection de l'explant.
Ou tu la rates, ou tu brule le végétal avec les desinfectants (alcool à 70°, javel, hypochlorite de calcium ou mercryl). Puis les multiples rinçages à l'eau stérile
Ou tu la réussis, et tu as encore les risques de contamination lors de la mise sur milieu gélosé.
Il faut carrément utiliser les méthodes de micro-biologie pour arriver à quelque chose.
Mais les possibilité de ce mode de multiplication sont énormes (micropropagation, embryogénèse somatique, haplo-dipoïdisatio par androgénèse ou gynogénèse).
Un site pas mal sur ce sujet :
http://perso.wanadoo.fr/technivit/presentation.htm

[Jesus666]

elle tue leur photo de gauche ca c de la bouture !!!!!

[Captain Igloo]

Voilà le sujet qui correspond aux couches bébés du forum "serre"...

[cannelle]

Bonjour, je suis nouvelle sur le forum et j'ai suivi cette discution avec intérêt.

J'ai travaillé en laboratoire de microbiologie, et le bec Bunsen est couramment utilisé pour créer une zone stérile (un cercle d'environ 10-15cm de rayon autour du bec). Le bec est utilsé en flamme chauffante (bleue). L'endroit le + chaud de la flamme est la pointe du petit cône sombre situé dans la flamme, vous le trouverez dans la moitié inférieure de la flamme.

Il faut essayer de travailler au plus près du bec Bunsen et passer à la flamme le matériel type pinces juste avant de s'en servir. Les boîtes ou les flacons contenant ne sont qu'entrouvert le temps nécessaire pour prélever ou ensemmencer puis immédiatement refermés. Les ouvertures de flacons et tubes en verre sont passés à la flamme systématiquement dès qu'on ôte le couvercle et avant de le remettre.

Bien évidemment avant toute opération, il faut nettoyer la table à l'eau de Javel et bien se laver les mains et les poignets.
Malgré ces précautions, on ne pose pas le couvercle sur la table, ni la pince. Le couvercle reste toujours dans une main, sans toucher l'intérieur du couvercle.

On ne parle pas et on évite d'éternuer sur son travail

Pour les milieux de culture, la cocotte minute convient bien, mais il faut laisser le milieu suffisemment longtemps, il me semble 1h30 (mais bon ca remonte à quelques années déjà, peut-être que je me trompe)
On peut aussi stériliser du matériel (pince, bistouri) il faut alors l'emballer dans de l'alu et le mettre dans la cocotte sur les flacons (faut pas que ca baigne dans l'eau ). On peut aussi stériliser des flacons vides fermés, ou des flacons contenant de l'eau distilllée additionnée de 5g/L de sel (j'ai cru comprendre qu'il y avait des rinçages à faire, alors a peut servir ).

L'agar agar, c'est effectivement ce qui est utilisé en microbio. En gros ca marche comme la gélatine.
Ne pas utiliser l'eau du robinet qui contient souvent du chlore.
Si vous utilisez de l'eau distillée, ne pas oublier de mettre du sel (5g/L) pour que le milieu soit isotonique.

S'il vous reste des questions sur l'asceptie ou les milieux de culture...

Par contre, je ne connais pas les milieux spécifiques pour plantes, je ne peux pas vous aider là-dessus.

[cannelle]

ou tu brule le végétal avec les desinfectants (alcool à 70°, javel, hypochlorite de calcium ou mercryl). Puis les multiples rinçages à l'eau stérile

Je pense qu'il vaut mieux éviter ce qui est toxique pour la plante (composés chlorés, mercryl...)
les rinçages doivent être faits à l'eau physiologique stérile (=eau distillée + 5g/L de sel de cuisine et ensuite on stérilise le tout)

et si on mets de l'engrais soluble complet type hydropponique, dans de la gelée ? peut etre que ca marcherais ?

oui c'est peut-être une bonne idée. Attention au dosage de l'engrais.
Souvent c'est bien de rester simple dans la composition du milieu de culture car beaucoup de substances supportent mal la chaleur de la stérilisation, surtout aussi longtemps. Donc on aurait tendance à mettre + d'engrais, mais il ne faut pas, non? Quand on mets trop d'engrais à une plante, on peut la brûler, je me trompe??

[Jean-Pierre]

Oui Cannelle, tu as tout à fait raison lorsque tu écris :

Je pense qu'il vaut mieux éviter ce qui est toxique pour la plante (composés chlorés, mercryl...)
les rinçages doivent être faits à l'eau physiologique stérile (=eau distillée + 5g/L de sel de cuisine et ensuite on stérilise le tout)

Mais comment fais-tu pour que les graines ou les boutures que tu implantes en milieu de culture n'apportent pas avec elles des spores de moisissures ou de multiples bactéries ? Parce que c'est bien ça le problème. Stériliser un milieu, c'est facile, utiliser des outils parfaitement désinfectés comme tu le décris c'est faisable avec un peu d'attention, mais à quoi est-ce que ça sert si au bout du compte tes graines ou boutures amènent avec elles tout ce qui faut pour transformer ton joli milieu de culture en infect cloaque ?

JP

[cannelle]

c'est bien celà le problème, je ne m'y connait pas la-dedans, puisque moi dans mon boulot, il fallait que les bactéries, levures et moisissures présentes dans les aliments poussent sur le milieu!!

Mais ce que je me dis c'est que la terre n'est pas strérile, est-ce nécessaire de supprimer tous les germes?
Peut-être est-il possible de mettre des antibiotiques pour limiter le développement des bactéries, et antifongiques pour les levures et moisissures??
Les antibiotiques sont couramment employer pour faire des milieux sélectifs. Le seul problème, c'est qu'il ne faut pas les mattre avant la strérilisation, mais après. Pour celà, il faut donc soit l'incoporer après la stérilisation quand le milieu est encore liquide mais pas brûlant. Soit faire refondre le milieu et le laisser refroidir dans un bain marie de façon à pouvoir prendre le flacon dans la main sans se brûler. Mais que le mileu soit encore liquide. Ajouter l'antibiotique et couler le milieu en boites ou tubes strériles.

Il y a aussi le pouvoir antibactérien et antifongique des huiles essentilles, en particulier le thym et la lavande. J'ai justement lu une publication scientifique la-dessus.


Une autre techinique permet d'inhiber la croissance des moisissures, puisque celles-ci ont besoin d'oxygène pour se développer. Il faut donc faire 2 flacons de milieu ou (1 seul et conserver le milieu estant au bain marie).
On coule le milieu en boite, on le fait sécher un peu, on ensemence puis on recouvre avec une couche de quelques mm (ou si dans un flacon avec l'autre moitié du milieu) C'est une solution pour les graines puisque de toutes façons il vaut mieux qu'elles soint en profondeur je pense.

Une autre méthode de désinfection des surfaces est couramment utilisée : la lampe UV. Les UV ne sont pas très pénétrants, donc ils ne désinfecteraient que la surface de l'objet, à tourner de temps en temps pour en exposer toutes les parties aux rayons.

J'ai lu aussi que les graines biologiques de haricots sont exposées au froid pour tuer les oeufs d'un insecte et qu'il était conseillé de répété l'oération en plancant les graines au congélateur. Pour les bactéries, celà rique de s'avérer inutile, puisque en général la congélation ne fait que diviser le nombre de bactéries par 2. Mais pour certains virus ca peut être efficace.

Si on part du principe que les germes ne sont qu'à la surface de la plante, et sur la tranche puisqu'on est susceptible de les avoir amenés en coupant, on peut peut-être faire celà :
Couper une grande partie de la plante, en désinfectant toute la surface avec un désinfectant (ou pourquoi pas, de la bouillie bordelaise??) . il suffirait ensuite de recouper de plus en plus petit en désinfectant à chaque fois la lame à l'alccol 90 puis en la passant à la flamme et en la laissant refroidir dans la zone strérile bien sûr avant de recouper. Le nombre de germes diminuerait à chaque opération, pour tendre à la fin vers la stérilité. Peut-être même qu'il serait intéressant de "peler" la plante comme un légume... :lol

Voici donc peut-être quelques pistes... peut-être en en combinant plusieurs...

[cannelle]

pour confectionner maison des antifongiques http://lepotager.free.fr/jardinbio.php

[Jean-Pierre]

Intéressant l'histoire des huiles essentielles... Je ne sais pas si ça a été utilisé. Je vais creuser de ce coté. Merci Cannelle.

Pour ce qui est de ton argument comme quoi la terre n'est pas stérile, tu as raison, mais dans le cas d'un semis ou d'un bouturage sur milieu gélosé, le problème c'est qu'il ne faut pas que le milieu soit envahi par les bactéries ou moisissures AVANT que les graines ou les boutures se soient développées.


JP

[cannelle]

oui tu as raison, il ne faut que 20 min pour qu'une population bactérienne se multiplie...la plante c'est légèrement + long!! Il ne resterait plus rien à manger pour la plante!!
merci de m'avoir corrigé

[moustache]

Bonsoir Cannelle,
Au moins, tu connais ton sujet
Pour la multiplication végétale in vitro, l'utilisation des antibiotiques est déconseillée.
On utilise de produits chimiques qui détruisent les micro-organismes :
hypochlorite de sodium (eau de javel)
hypochlorite de calcium
Mercryllaurylé (mercurobutol)
bichlorure de mercure
ethanol à 70-80°( le titre de 90° n'est pas efficace).
l'action de ces divers produits doit être minutée avec précision, et suivie de nombreux rinçages à l'eau déminéralisée stérile.
Le matériel végétal doit ensuite être "retailler" aseptiquement pour éliminer les parties "grillées" par la désinfection.
Pour cela, on peut travailler au voisinage d'une flamme (comme faisait Pasteur", ou dans des "hottes à flux laminaire" (courant d'air stérilisé par rayonnement UV ou filtres spécaux).
Mais cela se fait bien, il suffit de connaitre les protocoles pour chaque végétal.

[cannelle]

Merci Moustache pour ces précisions. Oui tu confirmes donc que ca brûle les tissus superficiels mais qu'en retaillant asceptiquement pas de problème.

Enfin bon, mes interventions c'est surtout pour essayer de faire avancer le Schmilblick, parce que pour l'instant je n'ai pas trop envie de me lancer la-dedans (faudrait peut-être que j'ai un jardin ).

Bonne chance à tous ceux qui se lancent la-dedans.

[moustache]

pour l'instant je n'ai pas trop envie de me lancer la-dedans (faudrait peut-être que j'ai un jardin ).

Pas nécessairement La culture in vitro ne se fait justement pas en jardin.
Toi qui maitrises bien les techniques de microbiologie tu devrais facilement y arriver.
Vas voir ces sites, tu découvriras toute les possibilités de cette technique.
http://perso.wanadoo.fr/technivit/techniquesciv.htm
http://www.cactuspro.com/article020.html
http://www.clivia.fr/tech.htm
@+

[cannelle]

Oui c'est vrai Moustache, pas besoin de jardin, mais besoin de beaucoup de temps.... et entre mon bébé et mon travail, je n'en n'ai pas beaucoup pour moi.
Et quitte à faire de la confiture, je préfère faire celle que je mange moi plutôt que pour des pantes... j'en ai trop fait avant.

J'ai quand même mis ces liens en favoris, pour + tard peut-être... si j'essaie un jour c'est promis je vous tiendrais au courant.

Moustache, est-ce que tu as essayé? et réussi ? Et les autres??

[moustache]

Moustache, est-ce que tu as essayé? et réussi ? Et les autres??

J'ai tout le materiel, car j'ai fait un semis d'orchidées (cattleya), et je suis arrivé au stad "protocorme", mais ça n'a pas été plus loin.
Mais ça me "démange" et je vais sans doute m'y remettre.
J'ai demandé à ma pharmacienne si elle pouvait me procurer de l'agar agar (pour gélifier le milieu) à un prix abordable. J'attend sa réponse.
Je te tiendrai au courant.